BCG培养及CFU检测方法

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  • 作者: 澳门永利登录网址   来源:http://www.helengibb.com    栏目:澳门永利官网网址55402    日期:2020-04-01
  •   BCG 培养及 CFU 检测方法 1. 准备 7H9 液体培养基 ? ? ? ? ? ? ? 在 450ml dH2O 溶解 2.35g 7H9 粉末 加 1mL 甘油,混匀 灭菌,冷却完全 按 1:9 比例加入 OADC 在室温暗处储存培养基-不用培养基可以储存超过一个月。 用之前, 加 Tween 80(过滤消毒),终浓度为 0.01%(0.22um 滤筛,针管, 棕色管) 补充。此时培养基可以过滤消毒或者直接使用。已经加了补充物和吐温的应 该在 4℃储存,并在几周内使用。 2. 在 20 毫升 7H9 液体培养基在 T75 瓶中,重悬一小瓶冷冻的 1 毫升 (450million)MTB or BCG(存储在 15%甘油和 85%7H9 液体培 养基),在无 CO2 的培养箱 37℃加湿培养 5-14 天。 用 M7H9 液体培养基(1ml)将 BCG 干粉打散混匀, 一、液体培养基培养(加玻璃珠) 1.接种适量(500ul)BCG 到 4ml M7H9 液体培养基中,160rpm 慢摇大 约 30 天,直到有乳白色浑浊出现。(枪、枪头) 2.将 4ml 培养基平均分(2ml)到两个锥形瓶(规格)中继续慢摇, 直到什么时候? 3.摇起来以后,如何保存? 二、固体培养基培养 1.取适量 BCG(500ul)涂到 M7H11 固体琼脂平板上,置于 37 度,两 星期后观察菌落的出现。 2.将菌落刮到 M7H9 肉汤培养基(体积)中,160rpm 慢摇,直到白色 浑浊出现。 问题: 1. CFU 测定 取适量摇好的 BCG(108/ml,计数范围在 5—200 个,按需要做梯度稀 释,每个稀释梯度需要三个板)涂在 M7H11 固体琼脂板上,37 度, (有无 CO2?),放置一个月,计数 2. 菌摇好后,用不加吐温的 M7H9 培养基重悬,即可感染细胞。 3. 感染方法:铺 THP-1 细胞后,根据所需 MOI 加入相应病毒量,3h 后,用 PBS 洗去多余病毒(离心),用 1640 培养基继续培养,20h 后检测细胞坏死。 4.结核分枝杆菌发生污染是什么现象?要如何鉴定? 3. 每五天检测 OD600, 知道 OD600 达到 2.0 (在什么地方取菌, 检测) 4.通过不同的细菌悬液的计数得到可行的 MTB/BCG 5. 在 Middlebrook 7H11 琼脂稀释板上,加 OADC,在两周后计数菌 落,计算细菌浓度(不知道涂板量)。 Middlebrook 7H11 琼脂平板制作: ? ? ? ? ? 在 900ml dH2O 溶解 21g 7H11 粉末 加 5ml 甘油,涡旋以达到温和的悬浮。如果有必要,可以煮沸以充分溶解粉 末 121℃高压灭菌 15min 当 培 养 基 冷 却 到 50-55 ℃ 的 时 候 , 加 100 mL Middlebrook OADC Enrichment 和 2.5 ml 20% Tween 80 (过滤灭菌),混匀并倒入琼脂板。 注:需购买 Middlebrook OADC Enrichment、7H11 粉末 6. 通过室温下自旋,6000g7 分钟,收获细菌。

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